Pelaksanaan Penelitian
a. Isolasi Senyawa Bioaktif Herba Ciplukan Fraksi Etil Asetat
1) Penyiapan Sampel
Sampel yang digunakan adalah herba ciplukan (Physallis angulata L.) yang masih segar, tidak rusak. Akar kemudian
dibersihkan dengan air mengalir dan bersih, selanjutnya herba ciplukan
dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada udara terbuka di dalam ruangan,
dengan tujuan agar tidak terkena paparan sinar matahari langsung. Sampel yang
telah kering disortasi agar diperoleh sampel bersih tanpa adanya pengotor,
kemudian sampel dipotong-potong kecil hingga diperoleh rajangan simplisia herba
ciplukan.
2) Ekstraksi Sampel
Simplisia herba ciplukan yang dihaluskan dimasukkan ke dalam wadah kaca
dan ditambahkan pelarut metanol hingga terendam seluruhnya. Kemudian diaduk
simplisia dengan batang pengaduk dan dilakukan perendaman selama 3x24 jam.
Filtrat yang diperoleh disaring dengan kertas saring dan dipekatkan dengan rotary evaporator.
3) Fraksinasi
Akan dibuat fraksi etil asetat dalam
proses fraksinasi ini. Ekstrak metanol herba ciplukan (Physallis angulata L.) ditimbang sebanyak 5 gram, ditambahkan
pelarut n-heksana sebanyak 50 mL kemudian ditambahkan pelarut etil asetat
sebanyak 50 mL dan dilakukan penggojokan di dalam corong pisah. Setelah
beberapa menit akan terbentuk 2 lapisan. Lapisan etil asetat ditampung dan
diperoleh fraksi etil asetat. Fraksi n-heksana yang terdapat dalam corong pisah
ditambahkan kembali pelarut etil asetat dan dilakukan penggojokan kembali
hingga terbentuk 2 lapisan, lapisan etil asetat dikeluarkan dan ditampung
kembali. Diulangi prosedur tersebut hingga 5 kali pengulangan. Lapisan atas
hasil fraksinasi dikeringkan atau diuapkan sehingga diperoleh ekstrak yang
sudah dipekatkan.
4) Isolasi
Senyawa
a) Penentuan Eluen dengan Kromatografi Lapis
Tipis
Pelarut yang digunakan adalah metanol dan kloroform yang
dicampurkan dalam perbandingan tertentu. Sampel ditotolkan pada plat KLT yang
telah disiapkan. Penotol yang digunakan adalah pipa kapiler. Totolan yang telah
dilakukan pada plat KLT dielusi dengan pelarut (eluen) dengan perbandingan
tertentu yang telah disiapkan sebelumnya. Kemudian plat KLT dikeringkan dengan
pengering rambut, lalu disemprotkan larutan penampakan spot, yaitu H2SO4.
Setelah penyemprotan, totolan tersebut dikeringkan dengan pengering rambut.
Jika tampak noda (spot) yang terpisah maka ditentukan perbandingan eluen.
b) Pengisian Kolom
(1) Pembuatan Bubur Silika
Diambil silika gel 100 gram, dimasukkan dalam gelas
kimia. Ditambahkan eluen (yang sudah didapat perbandingannya) secukupnya.
(2) Penyiapan Kolom
Disiapkan statif dan klem untuk menopang kolom
kromatografi, dipasang tabung kolom hingga didapat posisi tegak lurus.
Dimasukkan kapas di dasar kolom lalu siap untuk dimasukkan eluen.
(3) Pengisian Kromatografi Kolom dengan
Bubur Silika
Kolom yang sudah bersih diisi dengan eluen yang terpilih
dari penentuan eluen pada kromatografi lapis tipis (metanol : kloroform). Keran
kolom dibuka agar eluen keluar dengan lancar. Kemudian dimasukkan bubur silika
sedikit demi sedikit sampai padat terisi di dalam kolom lalu dibiarkan kolom terendam dengan eluen selama satu malam.
c) Proses Isolasi Senyawa dengan
Kromatografi Kolom
Sampel sebanyak 1 gram dicampurkan dengan silika gel.
Sampel tersebut kemudian dimasukkan ke dalam kolom yang selanjutnya dilakukan
pengelusian. Adapun pola elusi yang digunakan adalah dengan peningkatan
kepolaran.
d) Penentuan Jumlah Senyawa dengan
Kromatografi Lapis Tipis
Hasil dari kromatografi kolom yang telah didapatkan
ditampung dalam botol vial masing-masing 5 ml, selanjutnya diamati dengan
kromatografi lapis tipis dengan eluen yang sesuai. Fraksi yang memberikan noda
dengan harga Rf yang sama dapat digabungkan.
e) Pemurnian Senyawa Hasil Isolasi
Untuk pemurnian lanjutan dilakukan dengan kromatografi kolom yang
menggunakan silika gel sebagai fase diam. Kolom yang sudah bersih diisi dengan eluen yang terpilih dari
penentuan eluen pada kromatografi lapis tipis (metanol : kloroform). Keran
kolom yang digunakan dibuka agar eluen keluar dengan lancar. Kemudian
dimasukkan bubur silika sedikit demi sedikit sampai padat terisi di dalam kolom
lalu dibiarkan kolom terendam dengan eluen selama satu malam.
Sampel yang akan dikolom sebanyak 1 gram digerus dengan silika gel ditambahkan
dengan metanol secukupnya lalu campuran tersebut diaduk, lalu didiamkan hingga
metanol menguap. Bubuk sampel tersebut dimasukkan kedalam kolom yang
selanjutnya dilakukan pengelusian dengan menggunakan eluen yang telah
ditentukan.
Hasil dari kromatografi kolom yang telah didapatkan ditampung dalam botol
vial masing-masing 5 mL, selanjutnya diamati dengan kromatografi lapis tipis
dengan eluen yang sesuai. Fraksi yang memberikan noda dengan harga Rf yang sama
dapat digabungkan.
Uji golongan metabolit sekunder dimulai dari fraksi hasil isolasi.
Metabolit sekunder yang diperoleh dideteksi dari hasil uji pada fraksi.
5) Identifikasi Metabolit Sekunder Isolat
a) Alkaloid
Disiapkan 2 tabung reaksi, dimasukkan ekstrak
kemudian masing-masing ditambahkan 1,5 mL asam klorida 2%. Tabung reaksi I ditambahkan
3 tetes pereaksi dragendroff, hasil positif ditandai ada tidaknya endapan
jingga coklat. Tabung reaksi II ditambahkan 3 tetes pereaksi meyer dan hasil
positif ditandai ada tidaknya endapan putih kekuningan.
b) Flavonoid
Ekstrak
kering dilarutkan dalam 1-2 mL metanol, ditambahkan pita magnesium dan 5 tetes
asam klorida kemudian diamati perubahan yang terjadi. Hasil positif bila
berwarna merah atau jingga.
c) Steroid dan Triterpenoid
Ekstrak ditambahkan 0,5 mL asam asetat, 0,5 mL kloroform, dan 1 mL asam
sulfat pekat kemudian diamati perubahan yang terjadi, hasil positif akan
terbentuk cincin merah coklat/ungu di bagian atas hijau/ungu.